Während es im letzten Post um den Reparatur-Aspekt unserer Mutanten ging, soll im nächsten deren Beteiligung an der DNA-Rekombination betrachtet werden. Doch das wird ohne ein wenig Hintergrundwissen zur homologen Rekombination nicht so leicht werden, deshalb habe ich mich für diesen hoffentlich nicht zu komplexen Einschub entschieden.Rekombination bedeutet zunächst, dass genetische Information zwischen zwei DNA-Molekülen ausgetauscht wird. Von den vielen Rekombinationsmechanismen ist die homologe Rekombination der konservativste. Das war jetzt keine politische Aussage, es bedeutet nur, dass es dabei idealerweise zu keiner Änderung der Sequenz kommt. Dies ist möglich, weil für die homologe Rekombination identische (= homologe) DNA-Sequenzen verwendet werden. Diese Sequenzen kommen bei diploiden Organismen wie dem Menschen oder Arabidopsis vom homologen Chromosom. Oder, noch besser, nach der Verdopplung der Chromosomen während der Replikation, vom Schwesterchromatid. Ausgangspunkt der homologen Rekombination ist immer ein Doppelstrangbruch. Dieser kann gewollt sein, etwa in der Meiose (dazu in einem anderen Teil der Paperübersicht mehr, wahrscheinlich #5). Alternativ kann ein Doppelstrangbruch aber auch durch ionisierende Strahlung oder Chemikalien ausgelöst werden. Dies wäre dann die Verbindung der homologen Rekombination mit der DNA-Reparatur.
Was wirklich während der homologen Rekombination passiert, wissen wir noch nicht hundertprozentig. Man kann diesen vorgang nicht live an einem DNA-Molekül mitverfolgen. Man kann aber seine Versuche so aufbauen, dass bestimmte Abläufe aufgrund des Ergebnisses ausgeschlossen werden können, andere Abläufe aber wahrscheinlicher werden. Viele solcher grundlegenden Experimente wurden mit der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae gemacht, bei der clever definierte Konstrukte in das Genom eingebracht wurden, die nach einer homologen Rekombination erlauben, Anteile von bestimmten Vorgängen zu ermitteln. Das hört sich jetzt sehr nichtssagend an, deshalb will ich kurz an einem schönen Beispiel zeigen was ich damit meine.
Das "Double Strand Break Repair" Modell der homologen Rekombination
1983 fassten Szostak et al. in einem Review-Artikel den damals aktuellen Stand der Rekombinationsforschung zusammen. Dabei stellten sie fest, dass bisher vorgeschlagene Modelle der homologen Rekombination selten auftrende Ereignisse während der Meiose nicht vorhersagen konnten. Wenn man beispielsweise zwei Marker betrachtet [1], die heterozygot und gekoppelt vorliegen (also gemeinsam auf einem Chromosom sitzen, aber nicht auf dem zweiten Chromosom eines diploiden Organismus), dann erwartet man in den Nachkommen die einfache Aufspaltung nach Mendel in 1:1 - eine Hälfte der Nachkommen hat das Chromosom mit beiden Markern erhalten, die andere Hälfte das homologe Chromosom ohne die Marker. Aufgrund der besonderen Chromosomensituation der damals untersuchten Pilzarten ist die Notation hier traditionellerweise nicht 1:1, sondern 4:4, das ändert am Verhältnis aber nichts. Man kann nun aber beobachten, dass manchmal auch andere Aufteilungen passieren, beispielsweise 6:2 (bzw. 2:6), oder auch 5:3. Hier muss Information von einem Chromosom auf ein anderes übertragen worden sein, oder ein Austausch zwischen zwei Chromosomen erfolgt sein, so dass die beiden Marker nicht mehr gekoppelt auf einem Chromosom vorliegen und unabhängig voneinander vererbt werden können. Diese beiden Vorgänge bezeichnet man als gene conversion und crossing over, und sie sind in Abbildung 1 aus Szostak et al. dargestellt (wenn auch in umgekehrter Reihenfolge):
Abbildung 1 aus Szostak et al. (1983). Zustand von zwei gekoppelten heterozygoten Markern A und B und die Effekte von crossing over (a) und gene conversion (b). Klicken für größere Version.
Woran liegt das nun? Szostak et al. schlagen einen Mechanismus vor, der auf der Reparatur von Doppelstrangbrüchen beruht. Dies war neu, denn die bisherigen Modelle gingen von Auslösern wie kurzen einzelsträngigen Bereichen auf der DNA (ssDNA nicks) aus. Von der Reparaturforschung war damals bereits bekannt, dass die Doppelstrangbruchreparatur in der Bäckerhefe sehr effizient ablief. Das neue Modell sollte also mit Doppelstrangbrüchen beginnen, und mit der Möglichkeit für sowohl crossing over, als auch gene conversion enden. Die Idee von Szostak und Kollegen sah folgendermaßen aus:
Doppelstrangbruchreparatur Modell (DSBR) nach Szostak et al. (1983). Klicken für größere Version.
Ausgehend von einem Doppelstrangbruch werden die freien Enden durch Proteine (Exonukleasen) so zurückgeschnitten, dass freie einzelsträngige Überhänge vorliegen. So eine ssDNA ist dann natürlich verfügbar für Basenpaarungen. Wenn nach einer "Homologiesuche" eine homologe DNA-Sequenz gefunden wird (die wie gesagt beispielsweise auf dem homologen Chromosom, oder auch dem Schwesterchromatid liegen kann), dann erfolgt die sogenannte Einzelstranginvasion: Der Einzelstrang lagert sich an die komplementäre Sequenz an und verdrängt dabei einen der vorhandenen Stränge. Die daraus resultierende Struktur wird D-Loop (displacement loop) genannt. Von hier an kann das freie Ende mit Hilfe einer DNA-Polymerase verlängert werden, was den D-Loop vergrößert. Irgendwann ist ein so großer Bereich DNA im D-Loop verdrängt, dass dieser mit dem zweiten freien Ende des Doppelstrangbruches paaren kann. Dies bedeutet auch, dass das erste freie Ende endlich mit der anderen Seite des Doppelstrangbruches verknüpft werden kann. Der DSB ist jetzt zwar repariert, aber wir haben nun eine problematische DNA-Struktur vorliegen - zwei DNA-Moleküle sind an zwei Positionen überkreuzt. So eine kreuzförmige DNA-Struktur nennt man übrigens nach ihrem Erstbeschreiber Holliday Junction (AHA!), bei den zwei Überkreuzungen hier spricht man von einer doppelten Holliday Junction (dHJ). Warum ist diese Struktur problematisch? Weil eine Zelle sich nicht teilen kann, bevor die dHJ aufgelöst wurde!
Und jetzt greift die Idee von Jack Szostak und Kollegen. Eine Endonuklease, also ein Protein das im Inneren eines DNA-Moleküles schneidet, kann an den Holliday Junctions Schnitte setzen, um die zwei Stränge voneinander zu trennen. Und abhängig davon, ob die beiden Schnitte symmetrisch (unten links) oder asymmetrisch (unten rechts) erfolgen, erhält man entweder ein crossing over (CO, rechts) oder eine gene conversion (auch noncrossover genannt, also NCO, links).
Seit 1983 ist viel Zeit vergangen, doch das DSBR-Modell hat sich gehalten. Mittlerweile wurde etwa gezeigt, dass in der Meiose ein spezielles Protein absichtlich Doppelstrangbrüche zur Einleitung der homologen Rekombination setzt: SPO11. Auch Holliday Junctions wurden bereits als Intermediate der Rekombination experimentell nachgewiesen.
"Synthesis-dependent strand-annealing" und das "revised model"
Um es jetzt noch ein wenig komplizierter zu machen, will ich der Vollständigkeit halber das Bild auf den aktuellen Stand bringen. Als 1994 die Gruppen von William Engels und Gregory Gloor (Nassif et al., 1994) Rekombinationsexperimente mit der Fruchtfliege Drosophila melanogaster machten, stießen sie auf Ergebnisse, die sich mit dem DSBR-Modell von Szostak et al. nicht vollständig erklären ließen. Letzen Endes waren ihre Ergebnisse nur zu verstehen, wenn man beiden freien Enden des DSB erlaubte, unabhängig voneinander die Rekombination mit verschiedenen Partnern einzuleiten. Eine Auflösung nach ihrem synthesis-dependent strand-annealing-Modell (SDSA) benötigte demnach keine Holliday Junction als Intermediat. Bereits nach Verlängerung des ersten freien Endes würde dieses aus dem D-Loop geworfen und für die Basenpaarung mit dem zweiten Ende zur Verfügung stehen. Durch solch einen Mechanismus wären keine Crossoverprodukte möglich.
2001 wurden die beiden konkurrierenden Modelle DSBR und SDSA dann gleichzeitig von zwei Gruppen zusammengefasst. In dem heute als revised model bezeichneten Prozess nach in der Bäckerhefe gewonnenen Ergebnissen von Hunter und Kleckner (2001) und Allers und Lichten (2001) beginnt die homologe Rekombination zunächst, wie ich es schon für DSBR und SDSA beschrieben habe. Die Aufteilung in die beiden Arme CO und NCO erfolgt jedoch schon vor dem dHJ-Intermediat, nämlich auf Ebene des D-Loop. Von hier ab kann dann die Rekombination entweder zum NCO aufgelöst werden, per SDSA-Modell. Oder eben über die doppelte Holliday Junction zum CO, das nach diesem Modell das einzige Ergebnis des DSBR-Weges ist.
revised model der homologen Rekombination nach Hunter und Kleckner (2001) und Allers und Lichten (2001). Klicken für größere Version.
Auf diesem Stand möchte ich es dann auch belassen für heute. Worauf ich hier überhaupt nicht eingegangen bin, sind die vielen Proteine, die diese ganzen Wege bevölkern. Von manchen kennt man recht gut ihre Position im Schema und ihre dortige Aufgabe, von vielen anderen weiß man aber nur ungefähr, in welche Hälfte des Modells sie passen.
Im nächsten richtigen Post dieser kurzen Serie werde ich dann, bewaffnet mit dem Hintergrund zur homologen Rekombination hier, Untersuchungen unserer Mutanten zur Rekombinationsrate vorstellen.
[1] Vor der Zeit der schnellen Sequenzierung, und auch vor dem Triumphzug der PCR waren solche Marker oft Sporenfarbgene der untersuchten Pilze, oder Antibiotika-Resistenzgene.
JW Szostak, TL Orr-Weaver, RJ Rothstein, FW Stahl (1983). The double-strand-break repair model for recombination Cell, 33 (1), 25-35 DOI: 10.1016/0092-8674(83)90331-8
N Nassif, J Penney, S Pal, WR Engels, GB Gloor (1994). Efficient copying of nonhomologous sequences from ectopic sites via P-element-induced gap repair. Mol Cell Biol., 14 (3), 1613-1625
Neil Hunter, Nancy Kleckner (2001). The Single-End InvasionAn Asymmetric Intermediate at the Double-Strand Break to Double-Holliday Junction Transition of Meiotic Recombination Cell, 106 (1), 59-70 DOI: 10.1016/S0092-8674(01)00430-5
T Allers, M Lichten (2001). Intermediates of Yeast Meiotic Recombination Contain Heteroduplex DNA Molecular Cell, 8 (1), 225-231 DOI: 10.1016/S1097-2765(01)00280-5
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