Projekt Paperübersicht Intermezzo: Homologe Rekombination

Während es im letzten Post um den Reparatur-Aspekt unserer Mutanten ging, soll im nächsten deren Beteiligung an der DNA-Rekombination betrachtet werden. Doch das wird ohne ein wenig Hintergrundwissen zur homologen Rekombination nicht so leicht werden, deshalb habe ich mich für diesen hoffentlich nicht zu komplexen Einschub entschieden.


Rekombination bedeutet zunächst, dass genetische Information zwischen zwei DNA-Molekülen ausgetauscht wird. Von den vielen Rekombinationsmechanismen ist die homologe Rekombination der konservativste. Das war jetzt keine politische Aussage, es bedeutet nur, dass es dabei idealerweise zu keiner Änderung der Sequenz kommt. Dies ist möglich, weil für die homologe Rekombination identische (= homologe) DNA-Sequenzen verwendet werden. Diese Sequenzen kommen bei diploiden Organismen wie dem Menschen oder Arabidopsis vom homologen Chromosom. Oder, noch besser, nach der Verdopplung der Chromosomen während der Replikation, vom Schwesterchromatid. Ausgangspunkt der homologen Rekombination ist immer ein Doppelstrangbruch. Dieser kann gewollt sein, etwa in der Meiose (dazu in einem anderen Teil der Paperübersicht mehr, wahrscheinlich #5). Alternativ kann ein Doppelstrangbruch aber auch durch ionisierende Strahlung oder Chemikalien ausgelöst werden. Dies wäre dann die Verbindung der homologen Rekombination mit der DNA-Reparatur.

Was wirklich während der homologen Rekombination passiert, wissen wir noch nicht hundertprozentig. Man kann diesen vorgang nicht live an einem DNA-Molekül mitverfolgen. Man kann aber seine Versuche so aufbauen, dass bestimmte Abläufe aufgrund des Ergebnisses ausgeschlossen werden können, andere Abläufe aber wahrscheinlicher werden. Viele solcher grundlegenden Experimente wurden mit der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae gemacht, bei der clever definierte Konstrukte in das Genom eingebracht wurden, die nach einer homologen Rekombination erlauben, Anteile von bestimmten Vorgängen zu ermitteln. Das hört sich jetzt sehr nichtssagend an, deshalb will ich kurz an einem schönen Beispiel zeigen was ich damit meine.

Das "Double Strand Break Repair" Modell der homologen Rekombination
1983 fassten Szostak et al. in einem Review-Artikel den damals aktuellen Stand der Rekombinationsforschung zusammen. Dabei stellten sie fest, dass bisher vorgeschlagene Modelle der homologen Rekombination selten auftrende Ereignisse während der Meiose nicht vorhersagen konnten. Wenn man beispielsweise zwei Marker betrachtet [1], die heterozygot und gekoppelt vorliegen (also gemeinsam auf einem Chromosom sitzen, aber nicht auf dem zweiten Chromosom eines diploiden Organismus), dann erwartet man in den Nachkommen die einfache Aufspaltung nach Mendel in 1:1 - eine Hälfte der Nachkommen hat das Chromosom mit beiden Markern erhalten, die andere Hälfte das homologe Chromosom ohne die Marker. Aufgrund der besonderen Chromosomensituation der damals untersuchten Pilzarten ist die Notation hier traditionellerweise nicht 1:1, sondern 4:4, das ändert am Verhältnis aber nichts. Man kann nun aber beobachten, dass manchmal auch andere Aufteilungen passieren, beispielsweise 6:2 (bzw. 2:6), oder auch 5:3. Hier muss Information von einem Chromosom auf ein anderes übertragen worden sein, oder ein Austausch zwischen zwei Chromosomen erfolgt sein, so dass die beiden Marker nicht mehr gekoppelt auf einem Chromosom vorliegen und unabhängig voneinander vererbt werden können. Diese beiden Vorgänge bezeichnet man als gene conversion und crossing over, und sie sind in Abbildung 1 aus Szostak et al. dargestellt (wenn auch in umgekehrter Reihenfolge):

Abbildung 1 aus Szostak et al. (1983). Zustand von zwei gekoppelten heterozygoten Markern A und B und die Effekte von crossing over (a) und gene conversion (b). Klicken für größere Version.

Woran liegt das nun? Szostak et al. schlagen einen Mechanismus vor, der auf der Reparatur von Doppelstrangbrüchen beruht. Dies war neu, denn die bisherigen Modelle gingen von Auslösern wie kurzen einzelsträngigen Bereichen auf der DNA (ssDNA nicks) aus. Von der Reparaturforschung war damals bereits bekannt, dass die Doppelstrangbruchreparatur in der Bäckerhefe sehr effizient ablief. Das neue Modell sollte also mit Doppelstrangbrüchen beginnen, und mit der Möglichkeit für sowohl crossing over, als auch gene conversion enden. Die Idee von Szostak und Kollegen sah folgendermaßen aus:

Doppelstrangbruchreparatur Modell (DSBR) nach Szostak et al. (1983). Klicken für größere Version.

Ausgehend von einem Doppelstrangbruch werden die freien Enden durch Proteine (Exonukleasen) so zurückgeschnitten, dass freie einzelsträngige Überhänge vorliegen. So eine ssDNA ist dann natürlich verfügbar für Basenpaarungen. Wenn nach einer "Homologiesuche" eine homologe DNA-Sequenz gefunden wird (die wie gesagt beispielsweise auf dem homologen Chromosom, oder auch dem Schwesterchromatid liegen kann), dann erfolgt die sogenannte Einzelstranginvasion: Der Einzelstrang lagert sich an die komplementäre Sequenz an und verdrängt dabei einen der vorhandenen Stränge. Die daraus resultierende Struktur wird D-Loop (displacement loop) genannt. Von hier an kann das freie Ende mit Hilfe einer DNA-Polymerase verlängert werden, was den D-Loop vergrößert. Irgendwann ist ein so großer Bereich DNA im D-Loop verdrängt, dass dieser mit dem zweiten freien Ende des Doppelstrangbruches paaren kann. Dies bedeutet auch, dass das erste freie Ende endlich mit der anderen Seite des Doppelstrangbruches verknüpft werden kann. Der DSB ist jetzt zwar repariert, aber wir haben nun eine problematische DNA-Struktur vorliegen - zwei DNA-Moleküle sind an zwei Positionen überkreuzt. So eine kreuzförmige DNA-Struktur nennt man übrigens nach ihrem Erstbeschreiber Holliday Junction (AHA!), bei den zwei Überkreuzungen hier spricht man von einer doppelten Holliday Junction (dHJ). Warum ist diese Struktur problematisch? Weil eine Zelle sich nicht teilen kann, bevor die dHJ aufgelöst wurde!
Und jetzt greift die Idee von Jack Szostak und Kollegen. Eine Endonuklease, also ein Protein das im Inneren eines DNA-Moleküles schneidet, kann an den Holliday Junctions Schnitte setzen, um die zwei Stränge voneinander zu trennen. Und abhängig davon, ob die beiden Schnitte symmetrisch (unten links) oder asymmetrisch (unten rechts) erfolgen, erhält man entweder ein crossing over (CO, rechts) oder eine gene conversion (auch noncrossover genannt, also NCO, links).

Seit 1983 ist viel Zeit vergangen, doch das DSBR-Modell hat sich gehalten. Mittlerweile wurde etwa gezeigt, dass in der Meiose ein spezielles Protein absichtlich Doppelstrangbrüche zur Einleitung der homologen Rekombination setzt: SPO11. Auch Holliday Junctions wurden bereits als Intermediate der Rekombination experimentell nachgewiesen.

"Synthesis-dependent strand-annealing" und das "revised model"
Um es jetzt noch ein wenig komplizierter zu machen, will ich der Vollständigkeit halber das Bild auf den aktuellen Stand bringen. Als 1994 die Gruppen von William Engels und Gregory Gloor (Nassif et al., 1994) Rekombinationsexperimente mit der Fruchtfliege Drosophila melanogaster machten, stießen sie auf Ergebnisse, die sich mit dem DSBR-Modell von Szostak et al. nicht vollständig erklären ließen. Letzen Endes waren ihre Ergebnisse nur zu verstehen, wenn man beiden freien Enden des DSB erlaubte, unabhängig voneinander die Rekombination mit verschiedenen Partnern einzuleiten. Eine Auflösung nach ihrem synthesis-dependent strand-annealing-Modell (SDSA) benötigte demnach keine Holliday Junction als Intermediat. Bereits nach Verlängerung des ersten freien Endes würde dieses aus dem D-Loop geworfen und für die Basenpaarung mit dem zweiten Ende zur Verfügung stehen. Durch solch einen Mechanismus wären keine Crossoverprodukte möglich.
2001 wurden die beiden konkurrierenden Modelle DSBR und SDSA dann gleichzeitig von zwei Gruppen zusammengefasst. In dem heute als revised model bezeichneten Prozess nach in der Bäckerhefe gewonnenen Ergebnissen von Hunter und Kleckner (2001) und Allers und Lichten (2001) beginnt die homologe Rekombination zunächst, wie ich es schon für DSBR und SDSA beschrieben habe. Die Aufteilung in die beiden Arme CO und NCO erfolgt jedoch schon vor dem dHJ-Intermediat, nämlich auf Ebene des D-Loop. Von hier ab kann dann die Rekombination entweder zum NCO aufgelöst werden, per SDSA-Modell. Oder eben über die doppelte Holliday Junction zum CO, das nach diesem Modell das einzige Ergebnis des DSBR-Weges ist.

revised model der homologen Rekombination nach Hunter und Kleckner (2001) und Allers und Lichten (2001). Klicken für größere Version.

Auf diesem Stand möchte ich es dann auch belassen für heute. Worauf ich hier überhaupt nicht eingegangen bin, sind die vielen Proteine, die diese ganzen Wege bevölkern. Von manchen kennt man recht gut ihre Position im Schema und ihre dortige Aufgabe, von vielen anderen weiß man aber nur ungefähr, in welche Hälfte des Modells sie passen.
Im nächsten richtigen Post dieser kurzen Serie werde ich dann, bewaffnet mit dem Hintergrund zur homologen Rekombination hier, Untersuchungen unserer Mutanten zur Rekombinationsrate vorstellen.


[1] Vor der Zeit der schnellen Sequenzierung, und auch vor dem Triumphzug der PCR waren solche Marker oft Sporenfarbgene der untersuchten Pilze, oder Antibiotika-Resistenzgene.

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JW Szostak, TL Orr-Weaver, RJ Rothstein, FW Stahl (1983). The double-strand-break repair model for recombination Cell, 33 (1), 25-35 DOI: 10.1016/0092-8674(83)90331-8
N Nassif, J Penney, S Pal, WR Engels, GB Gloor (1994). Efficient copying of nonhomologous sequences from ectopic sites via P-element-induced gap repair. Mol Cell Biol., 14 (3), 1613-1625
Neil Hunter, Nancy Kleckner (2001). The Single-End InvasionAn Asymmetric Intermediate at the Double-Strand Break to Double-Holliday Junction Transition of Meiotic Recombination Cell, 106 (1), 59-70 DOI: 10.1016/S0092-8674(01)00430-5
T Allers, M Lichten (2001). Intermediates of Yeast Meiotic Recombination Contain Heteroduplex DNA Molecular Cell, 8 (1), 225-231 DOI: 10.1016/S1097-2765(01)00280-5

Projekt Paperübersicht #2: Der RTR-Komplex in Pflanzen?

Und weiter gehts mit der Besprechung unseres aktuellen Papers! Während es in Teil 1 noch um ein wenig Hintergrund für die beteiligten Gene/Proteine ging, gehts heute ins Pflanzengenom und die Frage, ob es diesen RTR-Komplex auch in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana gibt.


Den Großteil unserer Arbeit machen wir mit Insertionsmutanten. Das sind Pflanzen, bei denen mit Hilfe des Bodenbakteriums Agrobacterium tumefaciens relativ große DNA-Fragmente in die Sequenz eines Gens eingeführt wurden. Dies führt im Endeffekt dazu, dass das Proteinprodukt dieses Gens nicht mehr hergestellt werden kann, die Pflanzenlinie unterscheidet sich also von Wildtyppflanzen nur darin, dass ein bestimmtes Gen ausgeschaltet wurde. Der Sinn hinter der Untersuchung von diesen Knockouts ist schnell einleuchtend: Vergleicht man Wildtyp und Knockoutlinie, dann ist sehr wahrscheinlich, dass jeder zusätzliche Defekt in der Knockoutlinie auf dem Ausfall des Gens beruht. Jetzt muss man nur noch umdenken - der Ausfall eines Gens führt zu bestimmtem Defekt, dann erfüllt dieses Gen normalerweise diese bestimmte Funktion, die ein Entstehen des Defekts verhindert.

Zunächst muss man sich natürlich fragen: Gibt es die Gene des RTR-Komplexes überhaupt in Arabidopsis? Hier kann man sich heutzutage sehr viel Arbeit sparen, dank sehr guter Bioinformatik und den frei zugänglichen Genomdatenbanken vieler Organismen. Was wir fanden, passt sehr gut den bereits beschriebenen Genen, vor allem aus der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae und dem Menschen.
Für das Gen RMI1 (bzw. BLAP75) gibt es im Arabidopsisgenom zwei mögliche Kandidaten. Einer davon (das Gen At5g19950) scheint nicht exprimiert zu werden, und auch von uns untersuchte Insertionsmutanten waren völlig unauffällig. Hierbei könnte es sich also um ein Pseudogen handeln. Der zweite Kandidat (At5g63540) war dafür umso interessanter, wie ich heute und in den folgenden Posts zu unserem Paper zeigen will. Dieses Gen wurde von uns darum AtRMI1 getauft [1].
Auf zum T aus RTR - der Topoisomerase. Hier war es leichter, weil als Homolog zu TOP3 bzw. TOPO3α nur ein mögliches Gen in Frage kam, At5g63920 oder AtTOP3α.
Ein wenig komplizierter wird es bei der RecQ Helikase. Bei dieser Familie wissen wir schon länger, dass es in Arabidopsis sieben Mitglieder gibt. Welche von diesen sieben ist nun aber das funktionelle Homolog zu der einzigen RecQ Helikase in Hefe, SGS1? Im Menschen ist dies unter fünf Familienmitgliedern das Gen BLM, und mit dem Aufbau dieser beiden Gene bewaffnet fallen schon ein paar der Arabdopsis RecQ Helikasen raus. Von den restlichen bleibt dann nur noch RECQ4A (At1g10930) übrig, wenn man bereits bekannte Eigenschaften der Mitglieder der RecQ Familie in Arabidopsis mit einbezieht (Hartung et al., 2007).

Glücklicherweise waren für diese Gene dann auch Insertionsmutanten verfügbar, mit denen wir arbeiten konnten.

Zum Abschluss jetzt noch ein paar "richtige" Daten. Die Beschreibung, wie und warum man bestimmte Gene überhaupt gefunden und benutzt hat, und wie die Mutanten aufgebaut sind, ist zwar ein wichtiger Teil eines Papers - es ist aber eher langweilig.
Es gibt eine relativ einfache Methode, die Beteiligung eines Gens bzw. dessen Proteinprodukts an der DNA Reparatur zu untersuchen: Schädigt man die DNA absichtlich, dann müssen diese Schäden repariert werden. Ist nun aber ein Gen ausgeschaltet, das in die Reparatur der DNA involviert ist, dann funktioniert die Reparatur logischerweise nicht mehr so gut. Das kann man auf verschiedene Weisen messen, wir bestimmen das relative Frischgewicht von behandelten Keimlingen verglichen mit gleich alten unbehandelten Keimlingen. Denn Probleme bei der DNA-Reparatur resultieren beispielsweise im Absterben der betroffenen Zellen, die sich dann auch nicht mehr Teilen oder Wachsen können. Die Folge: Kleinere, leichtere Keimlinge.
Die Bandbreite an möglichen Schäden an der DNA ist unheimlich groß, entsprechend gibt es auch jede Menge von Reparaturwegen. Indem man die Organismen verschiedenen Stoffen mit bekannten Schadeffekten an der DNA aussetzt, kann man mit diesem Versuch auch eine erste Einordnung der untersuchten Gene in diese Reparaturwege vornehmen. Eine Knockoutmutante wird nämlich nur dann sensitiver als der Wildtyp auf einen Stoff reagieren, wenn es in dem betroffenen Reparaturweg aktiv ist.

Abbildung 3 aus Hartung et al (2008)

In dieser Abbildung sind Sensitivitäten von Knockoutmutanten der Gene RECQ4A, TOP3α und RMI1 gegenüber verschiedenen Mutagenen gezeigt. Gegen Methylmethansulfonat (MMS, A in der Abbildung) sind viele Gene der homologen Rekombination sensitiv, so auch unsere drei Gene. MMS erzeugt Addukte an der DNA, indem es eine Methylgruppe an Stickstoffatome in den Basen der DNA hängt. Dies hat zu Folge, dass die normale Doppelhelix verzerrt wird, und elementare Vorgänge wie die Transkription und Replikation nicht mehr stattfinden können. Dies ist wahrscheinlich auch die Verbindung mit der homologen Rekombination, da sie mithilft Probleme direkt an der Replikationsgabel zu beheben. Davon abgesehen können Schäden durch eine Alkylierung aber auch durch die Reparaturwege der Basenexzisionsreparatur und der Nukleotidexzisionsreparatur behoben werden [2]. Die Ungenauigkeit dieser beiden Wege führt übrigens über den Umweg von Mutationen zu einer krebsfördernden Wirkung von MMS.
Cisplatin (genauer cis-Diamindichlorplatin, B in der Abbildung) ist ein interessanter Stoff. Über die eher zufällige Entdeckung dieses kleinen Moleküls habe ich schon mal geschrieben. Heute ist es einerseits eines der am häufigsten eingesetzten Chemotherapeutika, andererseits aber auch eines der bestuntersuchten Stoffe, was die Mechanismen der DNA-Schädigung angeht. Was passiert, wenn Cisplatin in die Zelle kommt? Das zentrale Platinatom reagiert freudig mit so ziemlich jedem Molekül, das es in die Finger kriegt. Deshalb findet man dann Platinaddukte an Zuckern, Fetten, Proteinen, aber eben auch der DNA. Blöd an der Sache ist aber, dass Cisplatin über seine beiden Chloridgruppen auch zweimal reagieren kann, und damit zwei vorher unverbundene Moleküle kovalent verknüpft. So werden dann schon mal Proteine an die DNA gebunden, oder noch schlimmer, zwei Basen der DNA kovalent verbunden. Dies nennt man Crosslinking, und davon gibt es zwei Möglichkeiten: entweder werden zwei Basen aus unterschiedlichen DNA-Strängen verknüpft (=Interstrang-Crosslink), oder es werden zwei Basen innerhalb eines Stranges verknüpft (=Intrastrang-Crosslink). Letzteres ist bei Cisplatin das häufigere Produkt, und auch hier liegen die Reparaturaufgaben bei der Nukleotidexzisionsreparatur und der homologen Rekombination (die besonders während der Replikation).
Zuletzt noch Camptothecin (CPT, C in der Abbildung). Das ist ein Alkaloid, das beispielsweise von der Pflanze Camptotheca acuminata zur Schädlingsabwehr gebildet wird. Und die Schädlinge, die an der Pflanze knabbern tun mir wirklich leid: Im vorigen Teil habe ich knapp beschrieben, was eine Topoisomerase mit der DNA macht. Camptothecin behindert diesen Vorgang der Topoisomerase 1. Genau in dem Zustand, wenn TOP1 kovalent mit der DNA verbunden ist und ein Einzelstrangbruch in der DNA vorliegt, bindet CPT daran und verhindert, dass die Topoisomerase die Lücke schließt und sich von der DNA löst. Dies hat zur Folge, dass bei der Replikation einerseits ein Protein kovalent verbunden auf der DNA sitzt und die Replikationsproteine behindert, und dass außerdem durch das Entwinden des Doppelstrangs aus dieser Lücke in der DNA plötzlich ein Doppelstrangbruch wird. Großes Problem, und sehr wahrscheinlich der Tod des hungrigen Schädlings [3].

Wie man sehen kann, sind alle Mutanten sensitiver als der Wildtyp (Col-0 in der Abbildung) gegenüber MMS und Cisplatin. Gegen CPT ist dagegen nur die Knockoutmutante von TOP3α sensitiv, die beiden anderen nicht. top3A-2 reagiert genau genommen auch auf MMS und Cisplatin sensitiver als recq4A-4 und rmi1-2. Während nun diese gemeinsamen Sensitivitäten eines der Indizien sind, dass die drei Proteine ihre Aufgaben gemeinsam erfüllen (also möglicherweise in einem RTR-Komplex), deuten die Resultate auch auf eine Sonderrolle für TOP3α hin. Auf die will ich aber erst im nächsten oder übernächsten Post eingehen - mit nem Cliffhanger müsst ihr einfach wiederkommen, oder?


[1] So wirklich neue und kreative Namen gibts bei Genen eher selten, aber es kommt vor. Siehe etwa das Gen SUPERMAN und sein Antagonist KRYPTONITE...
[2] Wenn ich jetzt noch anfange, jeden Reparaturweg ausführlich zu beschreiben werde ich gar nicht mehr fertig mit dem Post. Ich hab da aber eine nette Idee: Ich könnte den Mutagenen eigene Posts widmen, und dabei dann auch auf die relevanten Reparaturwege eingehen.
[3] Die Camptothecin-produzierenden Pflanzen besitzen übrigens TOP1-Gene mit leicht veränderten Sequenzen, so dass sie selbst nicht anfällig gegenüber CPT sind (Sirikantaramas et al, 2008).

Projekt Paperübersicht #1: Der RTR-Komplex

Leider gab es nicht so viele Rückmeldungen auf meine Frage, ob ich über ein aktuelles Paper, bei dem ich Mitautor bin, hier berichten soll. Die Umfrage in der Sidebar wurde genau 1 Mal angeklickt. Da das Ergebnis nun aber bei 100% für das Erklären steht, werde ich das auch tun. Nur werde ich, wie caesar im Kommentarteil geschrieben hat, auf ein Einstellen bei researchblogging verzichten. Deren Richtlinien verbieten zwar nicht das Schreiben über eigene Paper, mir scheint das aber trotzdem nicht vertretbar zu sein.
Da in dem Paper mehrere Punkte zur Sprache kommen, die auch auf eigenen Beinen stehen können, werde ich die Besprechung des Papers aufteilen. So wird das nicht ein Megapost, und ich kann jeweils besser auf den Hintergrund eingehen.

Heute beginne ich damit, die für das Paper relevanten Gene und ihre Proteinprodukte kurz vorzustellen, dass jeder eine Vorstellung über ihre Funktion in der Zelle hat. Zentral steht hier ein Komplex aus drei Proteinen, die für sich alleine gänzlich unterschiedliche biochemische Eigenschaften haben.

Über die Familie der RecQ Helikasen habe ich bisher nur sehr wenig geschrieben, obwohl ich mich schon seit meiner Diplomarbeit mit ihnen beschäftige. Aus dem Biounterricht kennen manche vielleicht noch den Begriff der Helikase für ein Protein, das für das Kopieren der DNA (die Replikation) benötigt wird. Da in der DNA zwei Stränge aneinandergelagert sind, kann sie erst dann kopiert werden, wenn die Basenpaarungen aufgelöst wurden. Dies wird durch eine Gruppe von Proteinen namens Helikasen erreicht, die unter Energieverbrauch aus einem Doppelstrang zwei Einzelstränge machen. Danach kann dann das lustige DNA-Kopieren starten. Helikasen werden jedoch nicht nur während der Replikation gebraucht - die meisten Vorgänge an der DNA benötigen die Hilfe einer Helikase, warum es von denen im menschlichen Genom auch laut der Proteindatenbank UniProt über 150 gibt. Beschäftigt man sich ein wenig intensiver mit dem Metabolismus der DNA, dann läuft man fast zwangsläufig einer Familie von Helikasen (also eine Gruppe von Proteinen, deren Gene evolutionär verwandt sind und alle ein einziges Gen als gemeinsamen Vorfahren haben), den RecQ Helikasen. Das liegt daran, dass Vertreter dieser Familie verschiedenste Aufgaben im Erhalt der DNA, so wie wir sie kennen, besitzen: Sie sind aktiv in der Rekombination und der Reparatur von DNA, man findet sie an den Enden der Chromosomen, der Telomere, wo sie für den Erhalt dieser Strukturen beitragen und somit beispielsweise ein schnelles Altern unserer Zellen verhindern. Andere Familienmitglieder nehmen Funktionen im Gene Silencing wahr (das auch als RNAi bekannte Phänomen wurde 2006 mit dem Nobelpreis belohnt). Biochemisch erfüllen RecQ Helikasen diese Funktionen in der Regel, indem sie besondere DNA-Strukturen [1] erkennen, und sie unter Energieverbrauch wieder auflösen. Fallen diese Funktionen in tierischen Zellen aus, dann kann Krebs entstehen.
Die allermeisten einzelligen Lebewesen besitzen genau eine RecQ Helikase, die als Allroundtalent die meisten dieser Aufgaben erfüllt. Interessanter, aber auch komplizierter, wird es in vielzelligen Lebewesen, da diese mehrere Gene für RecQ Helikasen in ihren Genomen tragen, die die Aufgaben untereinander aufgeteilt haben. Menschen haben beispielsweise 5, Arabidopsis sogar 7 RecQ Gene. Ein recht gut untersuchtes Familienmitglied beim Menschen heißt BLM, weil es durch Mutation die verheerende Erbkrankheit Bloom Syndrom auslösen kann. Funktionell entspricht dies in Arabidopsis dem Gen RECQ4A. Beide unterdrücken die Rekombination und sind involviert in bestimmte Arten von DNA-Reparatur. Zumindest ein Teil dieser Aufgaben wird in dem RTR-Komplex wahrgenommen, um den es heute geht. Darum will ich es auch gut sein lassen für jetzt.

Das zweite Protein im Komplex ist eine Topoisomerase. Sie wird in der Bäckerhefe TOP3, in vielzelligen Eukaryoten TOPO3α genannt. Topoisomerasen lösen topologische Probleme der DNA - darum der Name. Ein einfaches Beispiel soll helfen zu verstehen, was damit gemeint sein soll: Stellt euch ein Gummiband vor; ein Ende macht ihr an einem Türgriff fest, das andere haltet ihr in der Hand. Nun verdrillt (überdreht) ihr das Gummiband. Wie lässt sich diese Überdrehung wieder auflösen, wenn die Enden fest verankert sind? Mit der DNA ist das etwas einfacher als mit einem Gummiband, aber genau das machen Topoisomerasen: Sie schneiden einen Strang durch, an dieser Position kann das Gummiband/die DNA nun frei drehen. Wenn die Überdrehung aufgelöst wurde (dies geschieht durch die in der Überdrehung gespeicherten Energie von selbst), schließt die Topoisomerase die Lücke wieder. Ein geschnittenes und geklebtes Gummiband würde man wohl nicht mehr benutzen, aber in der DNA bedeutet dies nur das Lösen und Verknüpfen einer Bindung im Molekül, das macht also keinen Unterschied [2].

Der dritte Komplexpartner heißt in der Bäckerhefe RMI1 und im Menschen BLAP75. Anders als die ersten beiden Proteine scheint es keine enzymatische Funktion zu besitzen. Trotzdem erfüllt der Komplex seine Aufgabe schlechter, wenn man dieses Protein daraus entfernt. Dies liegt wahrscheinlich daran, dass RMI1/BLAP75 einerseits die Erkennung von und Bindung an besondere DNA-Strukturen fördert, und andererseits Helikase und Topoisomerase im Komplex zusammenhält. Auf diese Weise können die beiden Proteine ihre Aufgaben kooperativ erfüllen.
Vor kurzem konnte gezeigt werden, dass der Komplex auch ein Protein namens RMI2/BLAP18 enthält. Dieses ist nahe verwandt mit RMI1, und beide ergänzen sich in ihrer Funktion. Außerdem ist schon bekannt, dass noch weitere, bisher unidentifizierte Proteine im Komplex enthalten sind.

Aufgrund der drei zentralen Proteine erhielt der Komplex jedoch seinen Namen - BTB für BLM, TOPO3α und BLAP75 im Menschen beziehungsweise RTR für RecQ Helikase, TOP3 und RMI1 in der Bäckerhefe. Was er genau mit der DNA anstellt, darauf will ich in einem gesonderten Post eingehen. Kurz erwähnen will ich nur noch, dass der RTR-Komplex vor kurzem die traurige Ehre zuteil wurde, von Kreationisten als "Argument" missbraucht zu werden.


[1] Wer sich schon gefragt hat, wo der nächste Post in der Serie DNA-Strukturen bleibt - schuldig im Sinne der Anklage. Es ist ja nicht so, dass mir da die Themen ausgingen. Es geht bald wieder weiter damit, versprochen!
[2] Es gibt noch eine zweite Form von Topoisomerasen. Die schneiden nicht einen, sondern beide Stränge der DNA durch. Das ist etwa dann nötig, wenn mehrere Chromosomen ineinander verknotet sind.

Ein nettes vorgezogenes Weihnachtsgeschenk

Nach Monaten von Warten kam letzten Freitag endlich das neueste Paper unseres Instituts raus - und ich bin einer der Mitautoren (Wenn auch nicht der Erstautor, was ich auf jeden Fall betonen will.)! Das ist zwar nicht mein erstes Paper [1], aber an dieser Arbeit war ich während meiner Diplomarbeit beteiligt und bin es auch aktuell während meiner Doktorarbeit.
Da der Artikel bei PLoS Genetics erschienen ist, kann ihn jeder kostenlos lesen, also super für Open Access! Spannend an der Geschichte ist auch, dass wir den Artikel back-to-back mit einem zweiten Paper der Gruppe von Mathilde Grelon aus Versailles veröffentlicht haben. Deren Ergebnisse ergänzen sich sehr gut mit unseren, so dass PLoS Genetics sogar noch nen Perspective-Artikel dazu hat schreiben lassen.
Ich bin jetzt gerade ein wenig unentschlossen, wie ich hier weitermachen soll. Einerseits halte ich das Thema für sehr interessant und spannend (natürlich!), andererseits kommt es mir aber extrem merkwürdig vor, über eigene Arbeiten zu schreiben. Wäre das nicht ein wenig wie Werbung? Haltet ihr mich für objektiv genug, oder sieht das dann so aus, als wollte ich unsere Daten in ein positiveres Licht rücken? Ich werd also eine kleine Umfrage in die Seitenleiste stellen, dann dürft ihr das entscheiden!

Hartung F, Suer S, Knoll A, Wurz-Wildersinn R, Puchta H (2008): Topoisomerase 3α and RMI1 Suppress Somatic Crossovers and Are Essential for Resolution of Meiotic Recombination Intermediates in Arabidopsis thaliana. PLoS Genet 4(12): e1000285.


[1] Darüber hatte ich vergessen zu berichten, das erste Paper bei dem ich Mitautor bin kam im Oktober raus. Mein Anteil an der Veröffentlichung geht noch auf ein längeres Praktikum während des Studiums zurück, am Institut für Rebenzüchung in Siebeldingen in der Südpfalz, einer Einrichtung des Julius-Kühn-Instituts (Bundesforschungsinstitut für Kulturpflanzen).

Kortekamp A, Welter L, Vogt S, Knoll A, Schwander F, Töpfer R, Zyprian E (2008): Identification, isolation and characterization of a CC-NBS-LRR candidate disease resistance gene family in grapevine. Molecular Breeding 22(3):421-432.

Plumps!

Das ist das Geräusch, das der Stein beim Auftreffen auf den Boden gemacht hat (der, der mir vom Herz gefallen ist). Die Diplomarbeit ist fertig geschrieben. Morgen stehen noch ein paar kleine Verbesserungen an, und dann wird gedruckt, gebunden, und abgegeben. Mann, ist das ne Erleichterung! Und der endgültige Titel steht auch fest:

Etablierung und Anwendung molekulargenetischer Methoden zur Charakterisierung von RecQ-Helikasen und ihren Interaktionspartnern in Arabidopsis thaliana.

Was für ein Brocken! ;-) Und zur Feier des Tages nochmal ein Post von Genomicron:

Guide to Translating Scientific
Papers Into Plain English

Statement	Really means
It has long been known...	I haven't bothered to look up the reference.
It is thought that...	I think so.
It is generally thought that...	A couple of other guys think so, too.
It is not unreasonable to assume...	If you believe this, you'll believe anything.
Of great theoretical importance...	I find it interesting.
Of great practical importance...	I can get some good mileage out of it.
Typical results are shown.	The best results are shown.
Three samples were chosen for further study.	The others didn't make sense, so we ignored them.
The second sample was not used.	I dropped it on the floor.
Results obtained using the second sample must be interpreted with caution.	I dropped it on the floor, but managed to scoop most of it up.
Correct within an order of magnitude.	Incorrect.
Much additional work will be required.	This paper isn't very good, but neither is anyone else's.
These investigations provided highly rewarding results.	My grant will be renewed.
This research was supported by a grant from...	Can you believe they pay me to do this?
A line of best fit was generated using least-squares regression.	I drew it by hand.
A non-linear relationship was found...	I drew it by hand and I didn't use a ruler.
Stringent controls were implemented...	My advisor was watching.
I thank X for assistance with the experiments and Y for useful discussions on the interpretation of the data.	X did the experiment and Y explained it to me.

http://genomicron.blogspot.com/2007/09/guide-to-translating-scientific-papers.html

kleine Pause...

es ist ja jetzt schon fast nen Monat seit dem letzten Post her...uff...und leider wird sich die Wenigposterei in den nächsten Wochen wahrscheinlich auch nicht ändern, weil ich doch recht viel mit meiner Diplomarbeit um die Ohren habe.
Aber als kleinen Trost hab ich noch nen Link zu einer Meldung von Heise, die auch mit Venter und der synthetischen Biologie zu tun hat (und der wartet auch schon mehr als ein paar Tage darauf, gepostet zu werden ;-))

können stumme Mutationen Gebärdensprache?

Immer diese Zufälle: genau an dem Tag, an dem ich die erste Sequenzierung während meiner Diplomarbeit zurück bekomme (sie war OK), sehe ich zufällig nen kurzen Artikel auf den Seiten des Seed Magazine: stumme Mutationen, zumindest was SNPs betrifft, sind nicht unbedingt stumm.
Erst mal kurz zur Erklärung: was ist mit stummen Mutationen gemeint? Wenn während der Translation die genetische Information von der mRNA in Protein übersetzt wird, codieren immer genau 3 Nucleotide (was man als Codon bezeichnet) aus der mRNA für eine Aminosäure. Das hat nun aber als Folge, dass 64 Codons nur 20 Aminosäuren gegenüberstehen, es müssen also mehrere Codons die gleiche Aminosäure codieren. In der Regel ist dies im genetischen Code so gelöst, dass besonders die dritte Base im Codon unterschiedlich sein kann, ohne dass es zum Einbau einer anderen Aminosäure kommt. Und von hier ist es jetzt nur noch ein kleiner Schritt zur stummen Mutation: Wenn durch eine Mutation die dritte Base eines Codons geändert wird, dann hat dies in den meisten Fällen keinen Einfluss auf die eingebaute Aminosäure, das Protein wird identisch zusammengebaut. Und da die natürliche Selektion auf der Ebene des Phänotyps agiert, kann sie keinen Unterschied zwischen keiner Mutation und einer stummen Mutation feststellen. Dachte man zumindest bisher...
In einer Arbeit von Kimchi-Sarfaty et al. wurde nämlich festgestellt, dass stumme Mutationen im Gen für MDR1 einen Effekt zeigen: MDR1 steht für Multi Drug Resistance und ist ein Membranprotein, das viele Medikamente, unter anderem Chemotherapeutika, aus der Zelle schleust. Darum ist dieses Gen in vielen Krebsarten mutiert. Was die Gruppe feststellte war nun aber, dass eine bestimmte MDR1-Variante mit ausschließlich stummen Mutationen die Medikamente besser als das Wildtyp-Gen aus der Zelle schleuste. Was eigentlich gar nicht sein dürfte!
Die Erklärung für dieses Phänomen bezeichnet man nun als "translational pausing", denn es hat in diesem Fall schon mit der Translation zu tun. Kimchi-Sarfaty et al. vermuten, dass es durch die unterschiedlichen Codons zu unterschiedlich großen Geschwindigkeiten beim Einbau der entsprechenden Aminosäure kommt. Und diese unterschiedlichen Geschwindigkeiten übersetzen sich in eine minimal andere Faltung des Proteins - was die biochemischen Eigenschaften dann letzten Endes verändert.

Das wirft dann aber die Frage auf: Wie groß ist der Einfluss von "stummen" Mutationen auf die Evolution? Könnte sich hier vielleicht ein erster, noch recht schwacher Ansatzpunkt für die Selektion bieten? Und, um den Bogen zum ersten Satz zu schlagen: Was, wenn ich in Zukunft eine stumme Mutation bei einer Sequenzierung finde? Kann ich es mir dann erlauben, trotzdem zu Transformieren, und Vergleiche mit dem Wildtyp zu ziehen? Oder soll ich doch noch mal für ein paar Wochen rumklonieren?
Und wo jetzt manche Leute vielleicht rummeckern würden, dass die Wissenschaft schon seit Jahrzehnten unter falschen Voraussetzungen arbeitet, finde ich so etwas gerade spannend, weil bisher wohl wirklich niemand damit gerechnet hat. Mal sehen was sich mit dem Thema noch ergibt!

Kimchi-Sarfaty, C. et al. (2007): A "silent" polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity. Science 315(5811):525-8.

was ist eine Holliday Junction?

Hat ein paar Tage gedauert mit dem Post, aber ich hab ne gute Ausrede - ich war krank (ne waschechte Virusgrippe). Außerdem hatte ich anschließend besseres zu tun als vor dem Rechner zu sitzen, wir haben nämlich 4 neue Mitbwohner bekommen, ne Familie Degus. Und die mussten natürlich ausgiebig beobachtet werden!
Mir ist vor ein paar Tagen plötzlich eingefallen, dass ich noch gar nicht erklärt hab, was es eigentlich mit dem Namen von meinem Blog, Holliday Junction, auf sich hat. Sorry falls ich jetzt ein paar Leute enttäuschen muss, aber es hat nichts mit Urlaub oder Feiertagen zu tun (und ist auch nicht falsch geschrieben), und mit ner (Straßen-)Kreuzung auch nicht. Wobei Kreuzung das Gebilde recht gut beschreibt...
Die Holliday Junction ist eine besondere DNA-Struktur, die sich bei vielen Prozessen der homologen DNA-Rekombination (z.B. während der Chiasma-Bildung in der Meiose) bildet, dass Sequenzinformationen zwischen homologen Bereichen von Chromosomen (egal, ob auf dem selben, einem homologen oder einem ganz anderen Chromosom) ausgetauscht werden können. Ihren Namen hat die Holliday Junction von dem Erstbeschreiber Robin Holliday, der bereits 1964 diese Struktur theoretisch beschrieben hat.
Auf den Seiten des Engels-Lab an der University of Wisconsin-Madison sind die Schritte von Entstehung, branch migration und Auflösung einer Holliday Junction in verschiedenen Animationen gezeigt, und dort findet man auch diese 3D-Animation:

wie versprochen: Bilder aus Karlsruhe

Mein Büro in der Botanik II

Es geht los!

Die dritte Woche meiner Diplomarbeit geht zu Ende, und ich will jetzt endlich mit dem bloggen anfangen.
Als Einstieg will ich kurz was über meine Diplomarbeit erzählen, sie hat nämlich etwas mit meinem Blogtitel zu tun. Der vorläufige Titel lautet "Charakterisierung und Interaktionsstudien von RecQ-Helikasen in Arabidopsis thaliana." So, und jetzt auf Deutsch: RecQ-Helikasen sind Proteine, die in Rekombination und DNA-Reparatur ungewöhnliche DNA-Strukturen auflösen, so dass diese Prozesse fehlerfrei weiterlaufen können. Ich arbeite von der botanischen Seite daran, mit der Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana als Modellorganismus (Arabidopsis besitzt gleich 7 homologe RecQ-Helikasen!). Hier untersuche ich nun verschiedene knockout-Mutanten (d.h. ein oder mehrere Proteine werden nicht mehr produziert oder sind zumindest nicht mehr funktionsfähig), wie sie auf genotoxischen Stress reagieren - ich setze sie z.B. verschiedenen Mutagenen aus, die unterschiedliche DNA-Schäden simulieren. Das war der Charakterisierungs-Teil im Titel, jetzt noch zu den Interaktionsstudien.
Proteine bilden untereinander ein Netzwerk von Interaktionen, d.h. sie gehen unterschiedlich starke Bindungen miteinander ein und beeinflussen sich auf diese Weise gegenseitig. Mich interessiert in meiner Diplomarbeit nun, mit welchen Proteinen die RecQ-Helikasen interagieren, um daraus auf die Abläufe in der DNA-Reparatur und Rekombination schließen zu können. Die Interaktion zwischen zwei Proteinen untersuche ich mit einer Methode, die sich bimolekulare Fluoreszenzkomplementation (BiFC) oder auch split-YFP nennt. Dabei verwende ich das gelb fluoreszierende Protein YFP, und hänge je eine Hälfte davon an die beiden zu untersuchenden Proteine. Ein halbes YFP kann nicht fluoreszieren, kommen die Hälften jedoch in räumliche Nähe (nämlich wenn Interaktion erfolgt), dann wird die Fluoreszenz wieder hergestellt. Das kann man am Fluoreszenzmikroskop in lebenden Zellen beobachten.

Ich glaube das reicht jetzt erst mal, außerdem ruft das Labor. Mal sehen, vielleicht kann ich ja zum nächsten Post schon ein Bild von meinem Büro anhängen.